儀器狀態確認：開機前檢查電源、數據線連接是否牢固，樣品室門是否關閉（部分儀器需 “關門" 狀態才能啟動），檢測器、光源（如氙燈）是否處于正常待機狀態（氙燈壽命有限，避免頻繁開關）。
環境控制：
溫度：保持實驗室溫度穩定（通常 20-25℃），避免溫度波動導致儀器部件（如光電倍增管）靈敏度變化；
濕度：濕度≤60%，防止光學元件受潮發霉（可配備除濕機）；
避光：關閉樣品室附近強光（如直射燈光），避免環境光干擾熒光信號檢測；
防震：儀器需放置在穩定臺面上，遠離離心機、真空泵等震動源，防止光學系統錯位。
試劑純度：空白溶劑（如去離子水、乙醇）需 “熒光級" 或高純度（如 HPLC 級），避免雜質自身熒光干擾；標準品需準確稱量、配制，濃度梯度覆蓋樣品預期濃度（通常 5-7 個梯度，確保線性關系）。
樣品預處理：
去除雜質：若樣品含懸浮物、顆粒物，需通過離心（3000-5000rpm，5-10min）或 0.22μm 濾膜過濾，防止堵塞樣品池或散射光干擾；
濃度適配：樣品濃度過高易導致 “熒光猝滅"（信號飽和），需提前稀釋至線性范圍內（可先做預實驗判斷濃度范圍）；
pH 調節：部分物質熒光強度受 pH 影響顯著（如氨基酸、黃酮類），需用緩沖液（如 Tris-HCl、磷酸鹽緩沖液）調節樣品與標準品 pH 一致。
材質適配：
常用石英樣品池（透光性好，紫外 - 可見區無吸收），避免使用玻璃池（玻璃對紫外光有吸收，會削弱激發光）；
根據樣品體積選擇規格（如 10mm 光程、3.5mL 容量的石英池為常規款），確保樣品量覆蓋光程（液面需高于進光孔 2-3mm）。
清潔流程：
新樣品池先用 10% 硝酸浸泡 2-4h，再用去離子水沖洗 3-5 次，烘干備用；
每次使用后，立即用樣品溶劑（如乙醇）沖洗 3 次，再用去離子水沖洗，最后用無塵紙吸干外壁水分（避免擦拭內壁，防止劃痕）；
若樣品殘留（如蛋白質、油脂），可用超聲清洗儀（20-30℃，5-10min）清洗，禁用強腐蝕性試劑（如濃鹽酸）。
打開電腦，啟動熒光光度計控制軟件（如 PerkinElmer 的 FL WinLab、Hitachi 的 F-7000 軟件）；
開啟儀器主機電源，選擇 “氙燈" 或對應光源（部分儀器需手動點亮光源），預熱 30min（關鍵步驟！光源和檢測器需穩定后才能檢測，否則信號漂移大）；
預熱期間，在軟件中設置儀器參數（提前規劃，減少預熱后等待時間）。
| 參數類別 | 設置要點 |
|---|---|
| 激發波長（λex） | 先通過 “激發光譜掃描" 確定：固定發射波長（參考文獻或預實驗值），掃描激發波長范圍（如 200-500nm），取熒光強度最大的波長作為 λex（避免干擾峰）。 |
| 發射波長（λem） | 固定 λex，掃描發射波長范圍（如 300-600nm），取熒光強度最大的波長作為 λem（注意：λem 需大于 λex，避免激發光散射干擾，即 “斯托克斯位移"）。 |
| 狹縫寬度 | 激發狹縫、發射狹縫寬度越小，單色性越好，但光強越弱（靈敏度降低）；反之則光強高，但雜散光增多。常規設置：2-10nm（濃度低時選寬狹縫，濃度高時選窄狹縫）。 |
| 光電倍增管電壓（PMT） | 電壓越高，靈敏度越高，但背景噪聲也會增加。設置原則：空白溶劑的熒光強度≤5% 滿量程（避免過載），通常在 400-800V 之間（不同儀器范圍不同）。 |
| 掃描速度 | 定性掃描（找波長）可慢（如 100nm/min），確保峰形清晰；定量檢測可快（如 300nm/min），提高效率（但需確認速度不影響信號穩定性）。 |
目的：扣除溶劑、樣品池、環境光的背景熒光信號，確保檢測信號僅來自待測物質。
操作：將空白溶劑注入石英池（液面至刻度線，避免外壁殘留液體），用無塵紙擦拭外壁后，放入樣品室的 “樣品架" 中（注意方向：光程面正對光路，不可反放），點擊軟件 “空白校正" 或 “調零"，待校正完成后取出空白池。
按濃度從低到高的順序，依次將標準品溶液注入樣品池，放入樣品室，點擊 “測量"，記錄每個濃度對應的熒光強度（F）；
測量完一個標準品后，用下一個標準品溶液潤洗樣品池 2-3 次（避免交叉污染），再注入新溶液測量；
全部標準品測量完成后，在軟件中以 “濃度（C）" 為橫坐標、“熒光強度（F）" 為縱坐標，生成標準曲線，計算線性回歸方程（R2 需≥0.998，否則需重新配制標準品）。
用樣品溶液潤洗樣品池 2-3 次，注入樣品溶液，放入樣品室，點擊 “測量"，記錄樣品的熒光強度（F 樣）；
若樣品需稀釋，需記錄稀釋倍數（n），將 F 樣代入標準曲線方程，計算樣品的 “稀釋后濃度"，再乘以 n 得到 “樣品原始濃度"；
每個樣品建議平行測量 3 次，取平均值（相對標準偏差 RSD 需≤5%，確保重復性）。
關閉光源（如氙燈），等待儀器冷卻 10-15min 后，關閉主機電源和電腦；
立即清洗樣品池（按 “操作前準備" 中的清潔流程），晾干后收納；
清理樣品臺，記錄儀器使用日志（包括使用時間、樣品類型、光源狀態、異常情況等）；
關閉實驗室電源、空調、燈光，確保環境安全。
氙燈啟動后需預熱穩定，禁止在預熱過程中關閉電源（易導致燈管損壞）；
單次使用時間不宜過長（建議≤4h），若中途暫停實驗，可開啟 “待機模式"（部分儀器有此功能），而非頻繁開關光源。
拿取樣品池時，僅接觸磨砂面（避免指紋污染透光面，指紋會產生散射光，干擾信號）；
樣品池放入樣品室時，需確保 “定位準確"（部分儀器樣品架有卡槽），若位置偏移，會導致光程不一致，數據偏差。
避免樣品中含強熒光雜質（如灰塵、有機物），若空白信號過高，需更換更高純度的溶劑或重新預處理樣品；
檢測過程中禁止打開樣品室門（開門會導致環境光進入，信號驟升，甚至損壞光電倍增管）。
標準曲線線性差：檢查標準品是否變質、配制是否準確，或儀器參數（如狹縫、PMT 電壓）是否合適；
樣品信號飽和（超過滿量程）：需稀釋樣品后重新檢測，避免 “熒光猝滅" 導致結果偏低；
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