高效液相色譜儀的主要操作要點 你了解了嗎？

一、開機(jī)前準(zhǔn)備：排除風(fēng)險，確保儀器 “就緒"

1. 流動相檢查與制備

• 溶劑需用色譜純級（如甲醇、乙腈），水需為超純水（電阻率≥18.2 MΩ?cm），避免雜質(zhì)污染色譜柱或檢測器；

• 若流動相含緩沖鹽（如磷酸鹽、醋酸鹽），需用 0.22 μm 濾膜減壓抽濾（有機(jī)相用有機(jī)相濾膜，水相用水相濾膜），防止鹽結(jié)晶堵塞管路；

• 混合流動相（如甲醇 - 水 = 7:3）需先混合再超聲脫氣（脫氣時間 5-10 分鐘），或通過儀器在線脫氣機(jī)，避免氣泡進(jìn)入泵體導(dǎo)致壓力波動、基線噪音。

• 流動相需符合 “無雜質(zhì)、無氣泡、適配色譜柱" 原則：

2. 色譜柱檢查

• 確認(rèn)色譜柱型號與實驗需求匹配（如反相柱 C18、正相柱 SiO?），檢查柱芯是否松動、柱效是否正常（可通過標(biāo)準(zhǔn)品驗證）；

• 若長期未使用，需先查看柱保存液（如 C18 柱常用甲醇保存），若流動相與保存液極性差異大（如保存液為甲醇，流動相為水），需用 “過渡流動相"（如 50% 甲醇 - 水）緩慢沖洗 20-30 柱體積，避免柱床塌陷。

3. 儀器狀態(tài)檢查

• 檢查輸液泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器（如紫外檢測器）的電源、數(shù)據(jù)線是否連接正常；

• 紫外檢測器需提前預(yù)熱（通常 30 分鐘），確保燈源（氘燈 / 鎢燈）能量穩(wěn)定（能量值需符合儀器要求，如氘燈能量≥800）。

二、開機(jī)與系統(tǒng)平衡：讓系統(tǒng)進(jìn)入 “穩(wěn)定狀態(tài)"

1. 開機(jī)順序：遵循 “先低后高、先泵后檢測器"

• 先打開計算機(jī)與色譜工作站，再依次開啟輸液泵、柱溫箱、檢測器，避免儀器電路沖擊；

• 柱溫箱需設(shè)置目標(biāo)溫度（如 25℃、30℃，波動≤±0.1℃），待溫度穩(wěn)定后再啟動泵（防止溫度變化導(dǎo)致流動相粘度波動，影響流速）。

2. 流動相流速與梯度設(shè)置

• 啟動輸液泵時，先以低流速（如 0.2-0.5 mL/min） 沖洗管路，逐步升至目標(biāo)流速（如 1.0 mL/min），避免突然高壓沖擊色譜柱；

• 若用梯度洗脫，需在方法中設(shè)置 “梯度程序"（如時間 0-10min，甲醇從 5% 升至 95%），確保梯度平滑無突變。

3. 系統(tǒng)平衡判斷

• 平衡核心是 “基線穩(wěn)定"：紫外檢測器基線漂移≤0.01 mAU/h，噪音≤0.005 mAU；

• 若流動相含緩沖鹽，需平衡 30-60 分鐘（或 20-30 柱體積），直至壓力、基線無波動，再進(jìn)樣分析。

三、樣品處理與進(jìn)樣：避免污染，保證重復(fù)性

1. 樣品預(yù)處理：關(guān)鍵在 “純凈度與溶解性"

• 樣品需溶解于流動相（或與流動相兼容的溶劑），避免沉淀堵塞進(jìn)樣閥或色譜柱；

• 用 0.22 μm 濾膜（與樣品溶劑匹配）過濾樣品，去除懸浮雜質(zhì)；若樣品濃度過高，需用流動相稀釋至線性范圍內(nèi)（通過標(biāo)準(zhǔn)曲線驗證）。

2. 進(jìn)樣操作：控制 “精度與一致性"

• 進(jìn)樣器（如 10 μL、20 μL 定量環(huán)）需提前用樣品溶液潤洗 3-5 次，避免殘留溶劑影響樣品濃度；

• 手動進(jìn)樣時，需 “快速切換閥位"（從 “Load" 到 “Inject"），且每次進(jìn)樣速度、力度一致；自動進(jìn)樣器需檢查樣品瓶密封性，避免溶劑揮發(fā)。

3. 進(jìn)樣后觀察

• 進(jìn)樣后實時監(jiān)控壓力、基線：若壓力突然升高（如超過柱壓上限），需立即停泵，排查是否有堵塞；若峰形異常（如拖尾、分裂），需檢查樣品是否污染或色譜柱是否失效。

四、數(shù)據(jù)分析與記錄：確保結(jié)果 “準(zhǔn)確可追溯"

1. 數(shù)據(jù)采集與積分

• 色譜工作站需設(shè)置合理的采集參數(shù)（如采樣頻率 10 Hz，積分閾值 0.001 mAU），避免漏峰或積分誤差；

• 手動積分時，需統(tǒng)一積分起點、終點（如峰高 10% 處），確保同批次樣品積分標(biāo)準(zhǔn)一致。

2. 結(jié)果驗證與記錄

• 用標(biāo)準(zhǔn)品驗證系統(tǒng)適用性：理論塔板數(shù)（N）≥2000（反相柱 C18），分離度（R）≥1.5，重復(fù)性（RSD）≤2%（n=5 次進(jìn)樣）；

• 詳細(xì)記錄實驗信息：流動相組成、色譜柱型號、柱溫、流速、進(jìn)樣量、標(biāo)準(zhǔn)品濃度、樣品編號、峰面積 / 峰高、計算結(jié)果等，確保數(shù)據(jù)可追溯。

五、關(guān)機(jī)后維護(hù)：延長儀器壽命的核心

1. 流動相清洗：重點在 “防鹽結(jié)晶"

• 若流動相含緩沖鹽（如磷酸鹽），關(guān)機(jī)前需用 “過渡流動相"（如 5% 甲醇 - 水）沖洗管路 + 色譜柱 30-40 分鐘（或 30 柱體積），再用純有機(jī)相（如甲醇、乙腈）沖洗 20-30 分鐘，避免鹽在管路或柱內(nèi)結(jié)晶（結(jié)晶會堵塞管路、破壞柱床）；

• 若流動相為純有機(jī)相（無鹽），直接用純有機(jī)相沖洗 15-20 分鐘即可。

2. 儀器部件維護(hù)

• 進(jìn)樣閥：用甲醇沖洗進(jìn)樣口（Load 狀態(tài)下，注入 100 μL 甲醇，切換閥位沖洗），避免樣品殘留；

• 檢測器：關(guān)閉檢測器燈源（氘燈壽命約 2000 小時，非使用時及時關(guān)閉，延長壽命），若長期不用，需用甲醇擦拭流通池窗口，防止污染。

3. 環(huán)境與記錄

• 關(guān)閉儀器電源、計算機(jī)，清理實驗臺；記錄儀器使用時間、燈源壽命、色譜柱使用次數(shù)等，為后續(xù)維護(hù)提供依據(jù)。

關(guān)鍵禁忌提醒

• 嚴(yán)禁用 “腐蝕性溶劑"（如濃酸、濃堿）直接進(jìn)入色譜柱（除非柱明確耐腐）；

• 嚴(yán)禁在 “無流動相" 狀態(tài)下啟動泵（會導(dǎo)致泵體干磨，損壞密封圈）；

• 嚴(yán)禁樣品中含 “固體顆粒或不溶物"，否則會直接堵塞色譜柱，不可逆損壞柱效。

高效液相色譜儀都在哪些領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用呢？